Fondamenti di Fisiologia Umana F. Volpicelli

La membrana plasmatica /1

Ogni cellula è delimitata esternamente dalla membrana cellulare (o plasmatica), di spessore tra 5-10 nm, che svolge due fondamentali funzioni:

• isolare fisicamente la cellula; 
• permettere lo scambio di sostanze, energia e informazioni con l'esterno. 

La membrana è costituita principalmente da un doppio strato di fosfolipidi (o "bilayer fosfolipidico") in cui fluttuano le proteine. 

La membrana plasmatica /2

Ciascun fosfolipide presenta una testa idrofila (gruppo fosfato) e due code idrofobe (catene di acidi grassi). Le teste idrofile sono rivolte verso l'esterno del bilayer, mentre le code idrofobe sono rivolte all'interno. 

Nella componente lipidica si collocano, con importanti funzioni fisiologiche, le proteine e una piccola percentuale di glucidi, in forma di glicoproteine e glicolipidi, e di molecole di colesterolo.

Il colesterolo svolge una funzione strutturale: aumenta la flessibilità e la stabilità del doppio strato lipidico e ne mantiene la fluidità, anche a basse temperature.

Le proteine di membrana /1

Le proteine di membrana, oltre ad avere un ruolo strutturale, svolgono diverse funzioni. Possono agire come:

• recettori di segnali extracellulari;
• enzimi (catalizzano le reazioni chimiche);
• molecole di adesione: mantengono la forma delle cellule e formano le giunzioni cellulari;
• proteine di trasporto.

Le proteine di membrana si disntinguono in due categorie: intrinseche (o integrali) ed estrinseche (o periferiche).

Le proteine di membrana /2. Le proteine estrinseche

Le proteine estrinseche:

• si legano alla membrana tramite legami non covalenti con proteine transmembrana o con le teste dei fosfolipidi; 
• non attraversano completamente la membrana cellulare, ma fuoriescono soltanto sulla faccia esterna o interna della membrana stessa. 

Le proteine estrinseche possono essere rimosse dalla membrana plasmatica mediante trattamenti relativamente blandi che lasciano intatto il doppio strato lipidico. 

Le proteine di membrana /3. Le proteine integrali o intrinseche

Le proteine integrali di membrana attraversano il doppio strato lipidico affacciandosi con le estremità dalle due facce della membrana. 

Alcune di esse, essendo molto lunghe, sono costrette a ripiegarsi e a formare spirali all’interno della membrana stessa, per questo motivo sono definite transmembrana. 

La maggior parte delle proteine trasmembrana della cellula eucariotica sono costituite da α eliche che attraversano il doppio strato fosfolipidico.

Le eliche all’interno di queste proteine possono scivolare l’una sull’altra, permettendo alla proteina di subire cambiamenti conformazionali che possono essere sfruttati per aprire o chiudere canali ionici, trasportare soluti, o trasdurre segnali extracellulari in segnali intracellulari. 

La fluidità della membrana permette ai suoi componenti di spostarsi nel bilayer formando configurazioni diverse (modello a mosaico fluido).

Grazie a questa struttura la membrana plasmatica è semipermeabile e svolge un'importante funzione selettiva.

La permeabilità della membrana

Il doppio strato fosfolipidico grazie alle sue caratteristiche strutturali permette la diffusione semplice solo di:

• acqua, gas (O₂, CO₂);
• piccole molecole idrosolubili (prive di carica), come ammoniaca, urea, etanolo e glicerolo;
• sostanze idrofobiche, come lipidi e ormoni. 

Il passaggio di ioni e molecole idrosolubili (elettricamente cariche) è assicurato da specifiche proteine di trasporto. La capacità di attraversamento della membrana dipende da due proprietà delle particelle:

• la solubilità nei lipidi;
• il diametro della molecola.

Le molecole piccole o liposolubili passano direttamente attraverso il doppio strato lipidico. Le molecole più grandi o meno liposolubili non possono attraversare la membrana senza specifici trasporti.

I trasporti di membrana

Il trasporto di un particolare ligando può compiersi con un processo:

1. passivo (diffusione semplice e diffusione facilitata): non richiede energia e le molecole si muovono secondo un gradiente elettrochimico. 
2. attivo (trasporto attivo): richiede energia e le molecole si muovono contro gradiente di concentrazione.

La diffusione è l’insieme dei movimenti casuali direzionali che portano ad uno stato di equilibrio. Il movimento netto di un soluto avviene da una regione a maggiore concentrazione verso una regione a minore concentrazione.

• 
  trasporti

La diffusione

La diffusione attraverso una membrana ha le seguenti proprietà:

1. È un processo passivo, che non richiede energia, sfrutta solo l’energia cinetica posseduta dalle molecole;
2. Le molecole si muovono da un’area a concentrazione più alta verso un’area a concentrazione più bassa (tanto maggiore è la differenza di concentrazione, tanto più rapidamente si verifica la diffusione);
3. Il movimento di molecole si ha fino a quando la concentrazione diventa uguale ovunque (equilibrio);
4. La diffusione dipende dalla distanza (è rapida a breve distanza e molto lenta su scala macroscopica);
5. È direttamente proporzionale alla temperatura (all’aumentare della temperatura il movimento delle molecole è più rapido e la diffusione più veloce);
6. È inversamente proporzionale alle dimensioni delle molecole (molecole di minore massa come O₂ e CO₂ rimbalzano più lontano negli urti rispetto alle molecole di maggiore massa).

La diffusione semplice

La diffusione semplice attraverso la membrana può essere espressa matematicamente dalla legge di Fick, che permette di calcolare la velocità di diffusione, quando sono note le concentrazioni delle due sostanze:

• 
  legge di fick

L'osmosi

Un processo diffusivo importante e cruciale per la sopravvivenza cellulare è il movimento di acqua attraverso le membrane.

Questo movimento può cambiare significativamente il volume cellulare e quello di un intero organo. 

Se tra due compartimenti (CI e CII) di uguale volume, esiste una membrana impermeabile al soluto, ma permeabile all’acqua, e un gradiente di concentrazione del soluto CI>CII, dopo un certo periodo di tempo l’acqua diffonderà passivamente attraverso la membrana verso il compartimento a maggior concentrazione di ioni e molecole organiche, annullando il gradiente di concentrazione.

L’aumento di volume di CI causa un innalzamento del livello di liquido e crea una pressione idrostatica che si oppone alla diffusione osmotica dell’acqua. Questa pressione necessaria per annullare la diffusione osmotica dell’acqua è detta pressione osmotica (p) ed è misurata in atmosfere (atm).

L'osmolarità

La concentrazione totale di soluti in una soluzione è definita osmolarità.

Una soluzione che contiene 1 mole (mol) di soluto in 1 litro (l) si dice 1 osmolare (OsM).

L’osmolarità normale di tutti i liquidi dell’organismo è circa 300 milliosmoli/l, in fisiologia si usa il termine milliosmolare (mOsM).

Una soluzione è definita:

• Isosmotica = se ha la stessa osmolarità della soluzione di riferimento (quella fisiologica di 300 mOsm).
• Iperosmotica = se ha un’osmolarità maggiore rispetto a quella fisiologica.
• Iposmotica = se ha un’osmolarità minore rispetto a quella fisiologica.

Tonicità

La tonicità, invece, è definita in base al comportamento di cellule o tessuti immerse in una soluzione. 

Una soluzione isotonica non crea cambiamento di volume e di forma alla cellula perché non c’è flusso netto di acqua.

Una soluzione ipertonica induce un movimento osmotico di acqua verso l’esterno e quindi un restringimento della cellula.       

Una soluzione ipotonica induce un flusso osmotico di acqua verso l’interno della cellula e quindi un rigonfiamento della cellula.

La diffusione facilitata

Il trasporto di ioni e di piccole molecole organiche solubili in acqua attraverso il doppio strato lipidico si realizza mediante proteine trasportatrici, ciascuna delle quali è responsabile del trasferimento di ioni o di molecole. Si tratta quindi di un processo altamente selettivo. 

Ci sono due classi principali di proteine di trasporto di membrana: 

1. Le proteine trasportatrici (carrier o permeasi): altamente specifiche nei riguardi della molecola da trasportare; dopo aver legato il soluto, modificano la propria conformazione, trasferendolo dall’altro lato della membrana. 
2. Le proteine canale: sono dei pori idrofili attraverso i quali diffondono principalmente ioni inorganici, secondo il loro gradiente elettrochimico; selezionano i soluti in base alla carica e alla dimensione; in molti canali la conformazione chiusa o aperta è regolata da uno stimolo esterno o interno alla cellula. Il trasferimento attraverso i canali è molto più veloce che attraverso i trasportatori.

La diffusione facilitata

Il trasporto mediato da proteine carrier si divide in:

• uniporto: un singolo tipo di soluto viene trasportato in una determinata direzione;
• simporto: i due soluti vengono trasportati da un unico carrier nella stessa direzione;
• antiporto: i due soluti vengono trasportati da un unico carrier in direzioni opposte.

Tutti i tipi di trasporto facilitato hanno 3 proprietà comuni:

1. Specificità: il carrier trasporta solo una molecola o gruppi di molecole molto simili (Es. la famiglia dei trasportatori GLUT trasporta solo zuccheri come mannosio, galattosio e fruttosio);
2. Competizione: se due molecole hanno affinità per lo stesso sito di legame del trasportatore, l’occupazione del sito da parte di una molecola ostacolerà il legame dell’altra. Questo effetto è detto inibizione competitiva (Es. glucosio e galattosio);
3. Saturazione: il trasporto facilitato raggiunge la saturazione quando la concentrazione del soluto è elevata e tutti i siti di trasporto dei carriers sono occupati.

Il trasporto attivo attraverso la membrana

Il trasporto attivo attraverso la membrana plasmatica è mediato da un trasportatore di membrana.

• Nel trasporto attivo è richiesto un apporto di energia metabolica che deriva direttamente o indirettamente dal legame fosfato ad alta energia dell’ATP. 
• Le molecole si muovono contro un gradiente elettrico, chimico o elettrochimico.

In funzione di come viene utilizzato l’ATP il trasporto attivo può essere suddiviso in:

1. primario (diretto): usa direttamente l'energia che deriva dal legame fosfato dell’ATP. Un tipico trasportatore primario, presente universalmente nelle cellule è la pompa sodio-potassio (o ATPasi sodio-potassio), che ha attività ATPasica, e che contribuisce al mantenimento del potenziale di membrana.
2. secondario (indiretto): non viene speso direttamente ATP, ma viene sfruttata l’energia di un gradiente di concentrazione che è stato precedentemente creato da un trasporto attivo primario (un esempio è il trasporto Na⁺- glucosio nell’epitelio intestinale e renale).

La pompa sodio-potassio

Tra i vari trasportatori attivi primari la pompa Na⁺/K⁺ è stata la prima a essere isolata, clonata e di essa si conoscono alcuni inibitori, come la digitossina, utilizzata nella cura dell’insufficienza cardiaca. La pompa Na⁺/K⁺ ha il principale compito di mantenere stabili i gradienti di Na⁺ e K⁺ ai lati della membrana di tutte le cellule. Le cellule eccitabili (neuroni, muscoli e cellule neuroendocrine) utilizzano il gradiente di Na⁺, Ca²⁺ e K⁺ per generare segnali elettrici e le cellule epiteliali utilizzano il gradiente di Na⁺ per assorbire nutrienti, ioni e acqua. Ad ogni ciclo la pompa Na⁺/K⁺, mediante cambiamenti conformazionali, trasporta 3 ioni Na⁺ fuori dalla cellula e 2 ioni K⁺ all’interno, consumando ATP. Il ripetersi del ciclo permette di mantenere bassi livelli di     Na⁺ e alti livelli di K⁺ all’interno della cellula e una situazione opposta all’esterno.

Unit 2 - Eccitabilità cellulare

Come misurare il potenziale di riposo della membrana /1

La membrana plasmatica di tutte le cellule presenta una differenza di carica elettrica tra l’interno e l’esterno. Questa distribuzione asimmetrica produce una differenza di potenziale elettrico detta potenziale di membrana (Vm).

Nelle cellule eccitabili (neuroni e fibrocellule muscolari) questa polarizzazione delle cariche può rapidamente cambiare, in risposta a stimoli specifici.

Come misurare il potenziale di riposo della membrana /2

Il potenziale di membrana può essere registrato mediante l’utilizzo di due microelettrodi di vetro, uno posto all’esterno della cellula (riferimento) e un altro all’interno (registrazione), connessi con un voltometro. Per convenzione il potenziale dell’elettrodo di riferimento viene posto a 0 mV. 

Quando il microelettrodo di registrazione viene a contatto con il liquido intracellulare si registra un potenziale negativo compreso tra -50 e -100 mV, a seconda del tipo di cellula.

Il potenziale di membrana a riposo

Perché succede questo?

I vari compartimenti del corpo (plasma, liquido intracellulare o LIC e liquido extracellulare o LEC) sono in equilibrio osmotico (300 mOsm), ma non in equilibrio chimico.

L’interno della cellula ha una concentrazione alta di ioni K⁺ e bassa di ioni Na⁺, rispetto all’esterno; viceversa, l’esterno ha una concentrazione alta di Na⁺ e bassa di K⁺.

Il numero di cariche positive e negative nel LEC e LIC è identico. 

Questa differenza di concentrazione ionica ai due lati della membrana è mantenuta dalla continua attività della pompa sodio-potassio. 

L’ampiezza di un potenziale di membrana a riposo quindi dipende da 2 fattori critici:

1. il gradiente di concentrazione degli ioni;
2. la differente permeabilità di membrana ai diversi ioni, che riflettono il numero di canali aperti per i vari ioni.

Maggiore è la permeabilità della membrana per uno ione rispetto ad altri, più quello ione contribuirà al valore del potenziale di riposo.

Il potenziale di equilibrio elettrochimico

Una membrana a riposo è molto più permeabile agli ioni K⁺ che agli ioni Na⁺.

Nell’unità di tempo, quindi, la quantità di K⁺ che esce dalla cellula è maggiore di quella di Na⁺ che entra. 

1. Il K⁺ esce liberamente secondo il suo gradiente di concentrazione, ma non raggiunge l'equilibrio grazie all'attività della pompa Na⁺/K⁺.
2. La diffusione di ioni K⁺ all’esterno crea un aumento della carica positiva extracellulare, al contrario, l'accumulo di proteine intracellulari crea in questo compartimento un aumento delle cariche negative.
3. Si genera così un gradiente elettrico che comincia ad attirare nuovamente il K⁺ verso l’interno della cellula. 

La forza elettrica, quindi, diventa sufficiente a opporsi al gradiente di concentrazione.

In queste condizioni si dice, quindi, che lo ione K⁺ ha raggiunto il suo equilibrio elettrochimico e la differenza di potenziale che si genera è chiamata potenziale di equilibrio del potassio (-90mV). 

Il potenziale di riposo

Allo stesso modo il Na⁺, che è maggiormente concentrato all’esterno può entrare nella cellula e muoversi secondo il suo gradiente elettrochimico (potenziale di equilibrio: + 63mV). 

Nelle cellule di mammifero Na⁺, K⁺ e Cl^- sono i 3 ioni che maggiormente influenzano il potenziale di membrana.

Considerando il contributo di ognuno di questi ioni, il potenziale di membrana nel neurone si aggira attorno ad un valore negativo di circa -70mV. 

In alcune cellule (es. nervose, muscolari, neuroendocrine), in seguito a uno stimolo chimico, termico o meccanico, questo potenziale di membrana a riposo può variare rapidamente nel tempo e può essere utile come segnale di comunicazione tra cellule. 

Perché ciò accada deve:

1. Esistere un gradiente stabile di concentrazione per i vari ioni, mantenuto dal lavoro continuo delle pompe ioniche;
2. la possibilità di aprire e chiudere canali ionici nel tempo e quindi cambiare la permeabilità della membrana mediante specifici meccanismi molecolari.

I potenziali graduati

Se in seguito a uno stimolo, il potenziale di membrana diventa più negativo (es. -90 mV) del potenziale di riposo, la membrana si dice iperpolarizzata. 

Quando, invece, il potenziale di membrana diventa meno negativo (es. -50 mV) la membrana si dice depolarizzata.

Gli impulsi di corrente, quindi, possono essere iperpolarizzanti (rendono più negativo il potenziale di membrana) o depolarizzanti (rendono più positivo il potenziale di membrana). 

Queste piccole variazioni di potenziale sono definite potenziali graduati, cioè escursioni locali del potenziale di membrana in funzione dell’intensità dello stimolo. 

Potenziale d'azione /1

Se una cellula riceve uno stimolo depolarizzante, sufficientemente elevato da spostare il potenziale di membrana fino a raggiungere un potenziale soglia, diverso per ogni tipo di cellula, parte il potenziale d’azione, che consiste in un'intensa e rapida depolarizzazione in grado di viaggiare a lunghe distanze senza perdere d’intensità. 

Il potenziale d'azione  è una risposta del tipo “tutto-o-nulla”, perché non varia né in ampiezza né in durata, ed è autorigenerativo perché il processo procede spontaneamente, finché non ritorna alle sue condizioni iniziali.

Una volta raggiunta la soglia il potenziale di membrana comincia a crescere rapidamente, oltrepassa lo zero e la polarità della membrana si inverte, raggiungendo un valore massimo (+30 e +60 mV) chiamato eccedenza.

Potenziale d'azione /2

Questa fase detta di depolarizzazione è dovuta all’apertura di canali Na⁺ voltaggio-dipendenti, che si aprono al valore soglia del potenziale e determinano un forte ingresso di Na⁺ all’interno della cellula. Questa rapida depolarizzazione del potenziale avviene grazie ad un meccanismo autorigenerativo a retroazione positiva, fino quasi a raggiungere il potenziale di equilibrio del Na⁺.

In seguito, la membrana si ripolarizza per inattivazione dei canali del Na⁺ e apertura di quelli del K⁺raggiungendo anche valori più negativi (potenziale postumo iperpolarizzante) del potenziale di riposo, per poi ritornare alle condizioni iniziali. 

Mentre le caratteristiche di base di un potenziale d’azione sono comuni ai vari tipi di cellule eccitabili, la forma di un potenziale può cambiare da cellula a cellula, riflettendo le funzioni che quel segnale deve svolgere per sostenere l’attività cellulare.

Canali del sodio voltaggio dipendenti

I canali del Na⁺ voltaggio-dipendenti hanno due cancelli: uno di attivazione e l'altro di inattivazione. 

Il cancello di attivazione è responsabile dell’apertura del canale del Na⁺ durante la fase di depolarizzazione, mentre quello di inattivazione è responsabile della chiusura dei canali del Na⁺ durante la fase di ripolarizzazione. 

A differenza del cancello di attivazione, il cancello di inattivazione non può essere aperto da un altro stimolo, fino a che la cellula non ritorna al potenziale di riposo.

Refrattarietà

Si definisce periodo refrattario, quel periodo durante il quale un secondo stimolo, di intensità uguale o anche superiore a quello che ha determinato il potenziale d'azione, non ha alcun effetto sul potenziale di membrana.

Refrattarietà assoluta: periodo durante il quale la cellula non è in grado di rispondere a nessuno stimolo indipendentemente dall’intensità.  I canali del Na⁺ sono completamente inattivi.

Refrattarietà relativa: periodo durante il quale il potenziale soglia è più elevato del normale. Uno stimolo più forte di quello che ha evocato il PA, ne può evocare un altro, ma di minore ampiezza. I canali del Na⁺ sono in parte già chiusi e in parte ancora inattivi.